赠送给初学者：常用的细胞凋亡检测方法

在实验之前经常须要扫描细胞连锁重排的增殖情况下，这里总结了几种类似的增殖扫描新方国法，希望须要帮到你。

一细胞连锁重排增殖的内部结构上学扫描

愈演愈烈增殖的细胞连锁重排在内部结构上上有一定的外观上。

光学设备光学设备和反转光学设备

未活体细胞连锁重排：增殖细胞连锁重排的棒状积变大、弯曲，细胞连锁重排表皮完备但显露现发泡现像，细胞连锁重排增殖晚期可见增殖小棒状。贴壁细胞连锁重排显露现皱缩、变圆、碎裂。

活体细胞连锁重排：会用姬姆萨活体、瑞氏活体等。增殖细胞连锁重排的活体质精制、忽视，连锁重排表皮甘油、活体质重叠成块状和增殖小棒状等十分相似的增殖内部结构上。

电子显微镜光学设备和共约催生激光扫描光学设备

一般以细胞连锁重排连锁重排活体质的内部结构上学忽略为当前来发型师细胞连锁重排增殖的困难重重情况下。

会用的 DNA 甲基立体化精油有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种精油与 DNA 的相结合都是非软件系统的，主要相结合在 DNA 的 A-T 碱基七区。紫外光唤起时人造卫星明亮的金色电子显微镜。

Hoechst 是与 DNA 特异相结合的活性精油，填充液用蒸馏水除此以外 1 mg/ml 的pH，使用时用 PBS 酒精，未成pH为 10 μg/ml。

DAPI 为半甲基立体化，常用同样通常细胞连锁重排的活体。填充液用蒸馏水除此以外 1 mg/ml 的pH，使用未成pH一般为 10 μg/ml。

结果发型师

细胞连锁重排增殖每一次之前细胞连锁重排连锁重排活体质的内部结构上学忽略分为三期：Ⅰ 期的细胞连锁重排连锁重排呈圆形波纹状（rippled）或呈圆形折缝样（creased），其余部分活体质显露现精制情况下下；Ⅱa 期细胞连锁重排连锁重排的活体质持续性汇聚、忽视；Ⅱb 期的细胞连锁重排连锁重排甘油为融立体化，归因于增殖小棒状（图 1）。

透射电子光学设备观察

结果发型师

增殖细胞连锁重排棒状积变大，细胞连锁重排质精制。增殖Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞连锁重排连锁重排内活体质持续性盘绕，显露现许多叫作气穴现像（citations）的空泡内部结构；Ⅱa 期细胞连锁重排连锁重排的活体质持续性汇聚、忽视；细胞连锁重排增殖的晚期，细胞连锁重排连锁重排甘油为融立体化，归因于增殖小棒状（图 2）。

二Annexin V 国法

糖蛋白酯丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）短星期坐落细胞连锁重排表皮的底部，但在细胞连锁重排增殖的更更早，PS 可从细胞连锁重排表皮的底部反转到细胞连锁重排表皮的表面，漏出在细胞连锁重排外环境之前（图 3）。Annexin-V 是一种底物量为 35～36 KD 的 Ca2+ 反之亦然糖蛋白相结合蛋白质，能与 PS 低亲和力甲基立体化相结合。将 Annexin-V 进行时异构立体化（FITC、PE）或 biotin 上亦同，以上亦同了的 Annexin-V 作为电子显微镜电子束，来进行流式细胞连锁重排郭子或电子显微镜光学设备可扫描细胞连锁重排增殖的愈演愈烈。

碘立体化丙啶（propidine iodide, PI）是一种连锁重排酸精油，它不用透过完备的细胞连锁重排表皮，但在增殖之前晚期的细胞连锁重排和死细胞连锁重排，PI 须要透过细胞连锁重排表皮而使细胞连锁重排连锁重排红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将增殖更早晚期的细胞连锁重排以及死细胞连锁重排七区分或多或少。

新方国法

漂浮细胞连锁重排的活体：将短星期养成和诱发增殖的漂浮细胞连锁重排（0.5～1×106）用 PBS 沾 2 次，转至 100 μl Binding Buffer 和 FITC 上亦同的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，气态避光 30 min，再转至 PI（50 μg/ml）5 μl，避光重排 5 min 后，转至 400 μl Binding Buffer，赶紧用 FACScan 进行时流式细胞连锁重排心法定量分析扫描（一般不多达 1 h）， 同时以不沙 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阳性解读。

贴壁养成的细胞连锁重排活体：先为用 0.25% 的胰蛋白质酶小肠，沾涤、活体和量立体化同漂浮细胞连锁重排。

钻进片细胞连锁重排活体：同上，之前用电子显微镜光学设备和共约催生激光扫描光学设备进行时观察。

结果

注意事项

1. 整个沙载低难度要尽量轻柔，切勿失去恒定吹打细胞连锁重排。

2. 沙载时注意避光，重排完毕后尽快在一星期内扫描。

三线粒棒状表皮电势的扫描

线粒棒状在细胞连锁重排增殖的每一次之前起着枢纽效用，多种细胞连锁重排增殖激发因子大多可诱发并不不尽相同的细胞连锁重排愈演愈烈增殖，而线粒棒状横跨低难度电位（Δψm）的增低，被看来是细胞连锁重排增殖一个系统重排每一次之前最更早愈演愈烈的重大事件，它愈演愈烈在细胞连锁重排连锁重排增殖外观上（活体质精制、DNA 松脱）显露现之前，一旦线粒棒状横跨低难度电位崩溃，则细胞连锁重排增殖不可避免。

线粒棒状横跨低难度电位的共存，使一些胺基酸镁电子显微镜精油如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可相结合到线粒棒状基质，其电子显微镜的减弱或减弱说明线粒棒状内表皮碱金属的增低或增大。

新方国法

将短星期养成的细胞连锁重排和诱发增殖的细胞连锁重排转至使用未成pH为 Rhodamine 123（1 mM）或未成pH为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 恒定 30 min，流式细胞连锁重排计扫描细胞连锁重排的电子显微镜强度。

注意事项

1. 始未成保持恒定染液之前 pH 值的一致性，因为 pH 值的转变将影响低难度电位。

2. 与精油降到恒定的细胞连锁重排悬液之前如果内含有蛋白质，他们将与其余部分精油相结合，增大精油的pH，招致骗介导。

四DNA 片段立体化扫描

细胞连锁重排增殖时主要的生立体化外观上是其活体质愈演愈烈精制，活体质 DNA 在连锁重排小棒状单位中间的两端松脱，演立体化成 50～300 kbp 长的 DNA 大块段，或 180～200 bp 整有数倍的寡连锁重排苷酸片段，在黏性电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。

细胞连锁重排经检视后，运常用同样新方国法剥离高纯度 DNA，进行时琼脂糖黏性电泳和溴立体化乙啶活体，在增殖细胞连锁重排群之前可观察到十分相似的 DNA ladder。如果细胞连锁重排量很少，还可在剥离高纯度 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧连锁重排糖连锁重排苷酸底部N-（TdT）上亦同 DNA，然后进行时电泳和放于射自显影，观察增殖细胞连锁重排之前 DNA ladder 的演立体化成。

大底物活体棒状 DNA 片段的测出

细胞连锁重排增殖的更更早，活体棒状松脱成为 50～300 kbp 长的 DNA 大块段。所有多达一定底物量体积的碱基 DNA 底物在琼脂糖黏性之前的迁移速度不尽相同。线性 DNA 的双螺旋运动速度多达黏性运动速度时，即降到分辨力的极限。此时黏性才会按底物量的体积来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其上端指向动量一极而通过黏性，这种迁移模式称之为「小动物」。因此，细胞连锁重排增殖更更早归因于的 50～300 kbp 长的 DNA 大块段不用用普通的琼脂糖黏性电泳来剥离。

通常运常用振幅电泳技心法可实相地解决这一问题。这个新方国法是在黏性上外沙对偶的交变振幅动量。每当动量同方向忽略后，大的 DNA 底物便滞留在小动物管之前，直至原先动量轴向再度定向后，才能继续向前快速移动。DNA 底物量越大，这种重排所须要的星期就越长。当 DNA 底物变换同方向的星期小于电振幅生命期时，DNA 就可以按其底物量体积分开。

DNA Ladder 测出

新方国法

进账细胞连锁重排（1×107）盐类→细胞连锁重排甘油液→13 000 rpm ×5 min→采集上清，沙 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，孵卵 2 h→蛋白质蛋白质酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 棒状积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍棒状积的冷无水甘油盐类 DNA，4 °C 旅店→14 000 rpm×15 min→之前将盐类溶解在 TE buffer 之前，沙 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖黏性电泳，EB 活体并光学郭子器。

结果

增殖细胞连锁重排 DNA 内含量的流式细胞连锁重排计量立体化

新方国法

采集细胞连锁重排→70% 冷甘油（PBS 酒精）4 °C 通常旅店→PBS 沾涤，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 小肠 30 min→PI（50 mg/ml）活体，气态避光 15 min→FACScan 量立体化 DNA 亚二倍棒状的演立体化成及细胞连锁重排生命期的转变。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

优点：准确性低，适合于扫描少量抽取，小其余部分增殖细胞连锁重排。如药理学活有组织扫描。

五TUNEL 国法

细胞连锁重排增殖之前，活体棒状 DNA 碱基松脱或单链松脱而归因于大量的黏稠 3'-OH 底部，可在脱氧连锁重排糖连锁重排苷酸底部N-（TdT）的效用下，将脱氧连锁重排糖连锁重排苷酸和异构立体化、过氧立体化物蛋白质酶、钠盐磷酸蛋白质酶或糖类演立体化成的酯上亦同到 DNA 的 3'-底部，从而可进行时增殖细胞连锁重排的扫描，这类新方国法叫作脱氧连锁重排糖连锁重排苷酸底部N-甲基立体化的缺口底部上亦同国法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于短星期的或准备增殖的细胞连锁重排几乎没有 DNA 的松脱，因而没有 3'-OH 演立体化成，很少须要被活体。TUNEL 严格来说是底物生物学与内部结构上学相相结合的深入研究新方国法，对完备的单个增殖细胞连锁重排连锁重排或增殖小棒状进行时原位活体，能准确地重排细胞连锁重排增殖十分相似的有机立体化学和内部结构上外观上，可常用石蜡包埋有组织活体、融立体化有组织活体、养成的细胞连锁重排和从有组织之前剥离的细胞连锁重排的细胞连锁重排内部结构上测出，并可扫描显露极少量的增殖细胞连锁重排，因而在细胞连锁重排增殖的深入研究之前被广泛运常用。

六Caspase-3 活性的扫描

Caspase 家族在甲基立体化细胞连锁重排增殖的每一次之前起着非常最主要的效用，其之前 Caspase-3 为关键的执行底物，它在增殖路径传导的许多唯一可之前发挥功能。Caspase-3 短星期以蛋白质酶原（32 KD）的型式共存于内膜之前，在增殖的更更早阶段，它被激活，再生的 Caspase-3 由两个大核苷酸（17 KD）和两个小核苷酸（12 KD）均是由，甘油可视的内膜胞连锁重排丝氨酸，最未成引致细胞连锁重排增殖。但在细胞连锁重排增殖的晚期和死亡细胞连锁重排，Caspase-3 的活性明显增低。

Western blot

量立体化 Procaspase-3 的再生，以及再生的 Caspase-3 及对丝氨酸多聚（ADP-连锁重排糖）聚合蛋白质酶（PARP）等的甘油。

新方国法

采集细胞连锁重排→PBS 沾涤→抽提细胞连锁重排甘油液→蛋白质定量分析→SDS-PAGE 电泳→纤维素表皮或 PVDF 表皮集中于→5% 脱脂封闭，气态 1.5～2 h 或 4 °C 旅店→Caspase-3 多抗或嘌呤气态重排 1～2 h 或 4 °C 旅店→TBS-T（内含 0.05% Tween 20 的 TBS）沾 3 次，5～10 min/次→HRP-上亦同的牛抗鼠 IgG 或 AP 上亦同的牛抗鼠 IgG 气态重排 1～2 h→ TBS-T 沾 3 次， 5～10 min/次→ECL 显影或 NBT/BCIP 盐类。

结果

电子显微镜分光光度计量立体化

再生的 Caspase-3 须要特异切割 D1E2V3D4-X 丝氨酸，裂解 D4-X 酪氨酸键。根据这一特点，设计显露电子显微镜物质催立体化作用的细酪氨酸 Ac-DEVD-AMC。在共约价催立体化作用时，AMC 不用被唤起电子显微镜，细酪氨酸被裂解后释放于显露 AMC，自由的 AMC 才能被唤起人造卫星电子显微镜。根据释放于的 AMC 电子显微镜强度的体积，可以测出 Caspase-3 的活性，从而突显 Caspase-3 被再生的程度。

新方国法

进账细胞连锁重排短星期或增殖细胞连锁重排→PBS 沾涤→制备细胞连锁重排甘油液→沙 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 电子显微镜丝氨酸）→37 °C 重排 1 h→电子显微镜分光光度计（Polarstar）量立体化电子显微镜强度（唤起光波长 380 nm，人造卫星光波长为 430～460 nm）。

结果

流式细胞连锁重排心法量立体化

新方国法

进账细胞连锁重排短星期或增殖细胞连锁重排→PBS 沾涤→沙 Ac-DEVD-AMC→37 °C 重排 1 h→UV 流式细胞连锁重排计量立体化 Caspase-3 阳性细胞连锁重排有数和平大多电子显微镜强度。

结果

七TFAR19 蛋白质隐含和细胞连锁重排出发点量立体化

TFAR19（PDCD5）是由本深入研究室在国际上首先为报导的一个具备自己自主的本能新基因，前期的功能深入研究表明，它是推动细胞连锁重排增殖的减弱剂。来进行异构立体化（FITC）上亦同的 TFAR19 单克隆抗棒状为电子束，对细胞连锁重排增殖每一次之前 TFAR19 蛋白质的隐含程度及出发点深入研究挖掘出，增殖更更早 TFAR19 隐含程度增低并显露现快速连锁重排一般而言现像，伴随着细胞连锁重排连锁重排内部结构上学的转变，持续性较长星期，在增殖小棒状之前仍然可见。

同时我们挖掘出，增殖更更早 TFAR19 蛋白质的连锁重排一般而言更早于糖蛋白酯丝氨酸（PS）外翻和细胞连锁重排连锁重排 DNA 的片段立体化，提示 TFAR19 蛋白质的连锁重排一般而言是细胞连锁重排增殖更更更早愈演愈烈的重大事件之一。进一步的深入研究证明了，增殖更更早 TFAR19 的连锁重排一般而言有着普遍意义，并不不尽相同细胞连锁重排增殖更更早大多显露现 TFAR19 低隐含和连锁重排一般而言。这为深入研究细胞连锁重排增殖更更早所愈演愈烈的重大事件，提供了一种原先技心法和当前。

TFAR19 蛋白质的细胞连锁重排出发点量立体化

碳立体化氢立体化

FITC 上亦同的单克隆抗棒状，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 内含 0.2% Tween 20），胎牛人体内，电子显微镜细胞连锁重排沾液（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 内含 2% 胎牛人体内及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 一头，移液器。

设备

低温程度离心机，37 °C 水浴箱，电子显微镜光学设备，共约催生激光扫描光学设备，流式细胞连锁重排郭子。

新方国法

1. 漂浮细胞连锁重排的活体

（1）进账短星期和诱发增殖的细胞连锁重排（0.5～1×106），PBS 沾 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 沾 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）转至 PBS-T 溶液，37 °C 孵卵 15 min，PBS 沾 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）转至 200 ml 胎牛人体内，气态重排 30 min。

（5）转至 5 ml FITC 上亦同的 TFAR19 嘌呤（未成pH为 1:40），4 °C 重排 30 min。

（6）电子显微镜细胞连锁重排沾液沾 2 次，1 000 rpm×10 min。

将细胞连锁重排盐类滴片，电子显微镜光学设备及共约催生激光光学设备下观察 TFAR19 在细胞连锁重排之前的出发点。同时用流式细胞连锁重排郭子定量分析扫描 TFAR19 蛋白质的平大多电子显微镜强度。

2. 贴壁细胞连锁重排的原位活体

（1）贴壁植被的对有数期细胞连锁重排铺在 24 孔或 6 孔支架之前（另有洁净盖玻片），让其钻进片植被，待长到 50%～80 % 满时，增殖诱发剂检视细胞连锁重排。

（2）将并不不尽相同星期点检视的细胞连锁重排进行时免疫电子显微镜活体，活体步骤同上。

（3）将活体的钻进片细胞连锁重排放于于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，电子显微镜光学设备或共约催生激光扫描光学设备观察 TFAR19 在细胞连锁重排之前的出发点。

3. 药理学病理活体的活体、扫描

4. 原代细胞连锁重排的养成、扫描

5. 量立体化 TFAR19 蛋白质在人棒状内各有组织肝脏的分布及出发点

TFAR19 蛋白质的隐含与药理学营养不良

ELISA 国法扫描短星期人和营养不良情况下下下，以及营养不良的并不不尽相同时期，人体内之前 TFAR19 蛋白质程度及其 TFAR19 自身抗棒状程度。

碳立体化和氢立体化

1. 特罗斯季亚涅齐 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 氯立体化物 Buffer

2. 沾涤液： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 内含 0.05% Tween 20

3. 封闭液： 3% BSA（用沾涤液配制）

4. 蛋白质酶亦同抗棒状的酒精：用封闭液酒精

5. OPD 丝氨酸 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，柠檬酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 盐类液（现配现用）：丝氨酸 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 未成止液 2 mol/L H2SO4

8. 重组人 TFAR19，HRP 上亦同的牛抗人 IgG9 ELISA 支架，Tip，移液器，ELISA Reader（OD 490 nm），沾支架机

沙载步骤

1. 用特罗斯季亚涅齐 Buffer 酒精的重组人 TFAR19（1 mg/ml）特罗斯季亚涅齐 ELISA 支架，100 ml/well，37 °C 孵卵 2 h 或 4 °C 旅店（一般 24 h 以上）。

2. 沾涤 Buffer 沾支架三次，转至封闭液，200 ml/well ， 37 °C 孵卵 2 h 或 4 °C 旅店。

3. 沾涤 Buffer 沾支架三次，转至并不不尽相同酒精度的病人人体内（3 个重复孔）100 ml/well ，37 °C 孵卵 1 h。设特罗斯季亚涅齐 Buffer、沾涤 Buffer 、封闭液为阳性解读。

4. 沾涤 Buffer 沾支架三次，转至 1:2 500 酒精的 HRP 上亦同的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 孵卵 1 h。

5. 沾涤 Buffer 沾支架三次，转至盐类液，100 ml/well，避光重排 10～15 min。

6. 转至 H2SO4 未成止重排，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读写 OD 490 光密度值，量立体化和来得病人人体内和短星期鲜血 清之前 TFAR19 自身抗棒状的隐含程度。

8. Western blot 量立体化功能障碍细胞连锁重排和短星期细胞连锁重排的 TFAR 19 蛋白质的隐含程度。

参考文献

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

评论来源：雪莲园圃站友 midas

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